Kesin Fungus Tür Tayini İçin Multilokus Dizi Analizi (Mlsa) Tabanlı Bir Yöntem Geliştirilmesi

Proje Özeti

Fenotipik analizlere dayalı geleneksel fungal taksonomi yöntemleri ağır iş yükü gerektirmekte, morfolojik özellikleri incelenen türe bağlı olarak standart olmayan farklılıklar gösterebilmekte ve yapay koşullar altında tekrarlanabilir sonuçlar elde edilmesini oldukça zorlaştırmaktadır [Katoch ve Kapoor, 2014]. DNA tabanlı moleküler tür tayini yöntemlerinin gelişmesi bu sorunların çözümü için bir alternatif sağlamıştır (Bruns ve ark, 1991). Fungal sistematikte filogenetik ilişkilerin ortaya konulması açısından en güvenilir sonuçlar rRNA sistronu gibi protein kodlamayan DNA bölgelerinin dizi analizi ile elde edilmektedir (Begerow ve ark, 2010). Fungal sistematikte en evrensel sonuçları veren mevcut DNA hedefi, İnternal Transkrpite Sekan (ITS) bölgesidir (Schoch ve ark, 2012). Ancak ITS bölgeleri bazı durumlarda yakın türlerin ayrımının yapılabileceği nükleotid farklılıklarını içermemektedir ve referans veri tabanlarında bulunan ITS dizilerinin güvenilirliği ile ilgili problemler bulunmaktadır [Kiss, 2012]. Fungal sistematikte birden fazla gen bölgesinin hedeflenmesi hem geleneksel yöntemlerdeki hem de ITS dizilemesindeki yetersizlikleri ortadan kaldırmaktadır (Taylor ve ark, 2000 ve 2003). Bu nedenle birden fazla genin hedeflenmesi fungide kesin tür tayini için daha uygun bir yaklaşım olarak ortaya çıkmıştır.

Multilokus dizi tiplendirmesi (MLST) (Urwin ve ark, 2003) ve Multilokus dizi analizi (MLSA) (Hanage vd 2006) görece yeni kullanılmaya başlanan, uygulanması kolay, hızlı, laboratuvarlar arası metot ve sonuç paylaşımına imkan veren, doğruluğu ve tekrarlanabilirliği yüksek moleküler sınıflandırma yöntemleridir. Bu yöntemler birbirinden bağımsız seçilmiş çeşitli ev-koruyucu (house-keeping) genlerin (6-10 gen) internal bölgelerindeki nükleotit dizilerinin belirlenmesi ve bu dizilerin bilinen türlere ait dizilerle karşılaştırılması esasına dayanmaktadır. MLST ve MLSA çoğu zaman birbirleri yerine kullanılan terimlerdir, ancak bu yaklaşım doğru değildir. MLST iyi tanımlanmış bir türe ait izolatların tiplendirilmesi, MLSA ise birbirne yakın türlerin birbirlerinden ayırılması için kullanılmaktadır. MLST’de genlerin allelleri numaralandırılmakta, tüm lokuslardaki allelleri aynı olan izolatlar aynı tip olarak kabul edilmekte; MLSA’da ise tüm lokus dizileri bir zincir şeklinde analiz edilmekte ve birbirleri ile ayırt edici kümelenmeler oluşturan izolatlar aynı tür olarak kabul edilmektedir. Günümüze kadar yapılan MLST tabanlı fungal sistematik çalışmalarında başarılı sonuçlar alınmıştır (Susca ve ark, 2013; Peterson ve Labeda, 2013). Bakteriyel sistematikte çok sık kullanılan MLSA (Gabriel vd 2014, Labeda vd 2014) ise fungal sistematikte az sayıda türün (Eisenberg ve ark, 2013; Nakamura ve ark, 2011) sınıflandırılmasında kullanılmıştır.

Mevcut bilgiler ışığında MLSAya dayalı kesin fungal tür tespiti mümkün değildir. MLSA kapsamında değerlendirilebilecek genleri hedefleyen mevcut PZR primerleri, ITS hariç tür spesifiktir ve tüm fungal türlerden bu genleri çoğaltacak evrensel primerlere ihtiyaçlar duyulmaktadır. Ayrıca, başlıca fungal türlere ait referans suşların sınırlı sayıda geninin DNA dizisi veri bankalarında mevcuttur. Evrensel DNA veri bankasında morfolojik ve biyokimyasal karakterizasyonunun ne kadar sağlıklı yapıldığı bilinmeyen fungal izolatlara ait gen dizilerinin bulunması, yeni fungal izolatlardan elde edilen bilgilerin, doğru bir şekilde analiz edilebilmesinin önünde engel teşkil etmektedir.

Önerilen proje ile sağlık üzerinde önemli etkileri olduğu bilinen ve geleneksel yöntemlerle kesin tür tayini yapılamayan 16 farklı fungus cinsine ait 124 farklı fungus türünün referans suşlarının 7 farklı lokus bilgisini içeren referans nitelikli bir Fungal MLSA veri tabanı oluşturulacak ve tür spesifik çoklu lokus dizilimlerine dayalı tür tahminini yapabilecek bir yazılım geliştirilecektir. Bu kapsamda, fungal sistematik için uygun olduğu bilinen ITS ve IGS1 (Schoch ve ark, 2012), Elongasyon faktörü 1α (EF-1α) (Peterson, 2006), β-Tubulin (Peterson ve ark, 2005), Calmodulin (Perrone ve ark, 2004), RNA Polimeraz I (RPB1) ve RNA polimeraz II (RPB2) (Lutzoni ve ark, 2004) lokuslarını hedefleyen, tüm fungal türlerden bu lokusları çoğaltabilecek evrensel primerler tasarlanacaktır. Tüm genom bilgisi veya hedef gen dizileri DNA veri bankasında bulunan referans suşların hedef gen bölge dizileri in siliko PZR yöntemi ile elde edilecektir. DNA veri bankasında bulunmayan bilgileri elde etmek için referans suşlar uluslararası kültür koleksiyonlarından temin edilecek, ilgili DNA bölgeleri PZR ile çoğaltılacak ve DNA dizi analizi yapılacaktır. DNA hizalama ve dendrogram oluşturma bioinformatik analizleri ile türlere özgü kümeler oluşturulacak ve yeni bir fungus izolatının bu kümelenmelerden birine ait olduğu yada yeni bir küme oluşturduğunu analiz edecek ve tür tahminini yapabilecek bir yazılım geliştirilecektir. Referans türlere ait bilgileri ve tür tahmini yapan yazılımı içeren internet erişimli, yeni türlere ait bilgilerin de yüklenebileceği dinamik, referans nitelikli bir Fungal MLSA veri tabanı oluşturulacaktır.

Projenin tamamlanması ile hedeflenen fungal türlerin kesin tür tayininin yapılması sağlanacaktır. Önerilen deneysel yaklaşım kullanılarak yapılacak yeni çalışmalar, proje kapsamı dışındaki fungal türlere ait bilgiler elde edilmesini mümkün kılacaktır. Bu yeni bilgilerle genişleyecek olan veritabanı zamanla evrensel bir nitelik kazanabilecektir. Proje çıktılarının kesin ve hassas fungal tür tayini gerektiren medikal mikoloji, gıda mikolojisi, fungal biyoteknoloji, çevre biyoteknolojisi, fungal genetik, sistematik, mikrobiyal ekoloji gibi birçok alanda geniş uygulama alanı bulması beklenmektedir.