Spor Oluşturmayan Küflerin Doğru ve Hızlı Tanımlanması için MLSA ile MALDI-TOF MS ve FT-IR Veri Tabanlarının Geliştirilmesi ve Metabolit Profillerinin Belirlenmesi

Proje Özeti

Küfler doğada her yerde bulunan hem yararları hem de zararları olan ökaryotik organizmalardır. Küflerin kesin tür düzeyinde tanımlanması ve hızlı yöntemlerin geliştirilmesi çoğunlukla spor oluşturan Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Alternaria gibi türler üzerine olmuştur. Spor oluşturan küfler gibi spor oluşturmayan küflerde çevre, gıda ve klinikten izole edilmiştir. Fakat bunların sporla fenotipik tanımlanması mümkün olmadığından özellikle klinikte ciddi enfeksiyonlara neden olan izolatlar moleküler tekniklerle tanımlanmışlardır. Gıda ve çevre çalışmalarında ise bu türler çoğunlukla “tanımlanamayan”, “steril hif” ya da “diğer türler” adı altında bırakılmıştır ve çalışılmamıştır. Ek olarak metabolitleri ile ilgili olarak literatürde çok az bilgi bulunmakta olup, sadece bir ya da iki izolat çalışılmıştır. Tüm dünya da literatüre baktığımızda bu türlerin kesin tanımlanması ve hızlı yöntemlerin geliştirilmesine yönelik bir çalışılmaya rastlanılmamıştır. Bu nedenle projemizde 3 temel amaç belirlenmiştir; 1-Gıda, çevre ve klinik örneklerden izole edilen farklı fenotipik özelliklere ve metabolit profiline sahip spor oluşturmayan küflerin kesin tür tanısının Multilokus Dizi Analizi (MLSA) oluşturularak yapılması 2-Kesin tür tanısı yapılan izolatların günümüzde özellikle klinikte hızlı tanımlama amacıyla kullanılan MALDI-TOF MS ve FT-IR sistemlerinde tanımlanması ve MLSA sonuçları ile yorumlanarak veritabanlarının oluşturulması, 3-Primer ve sekonder metabolitlerinin belirlenmesi ve bunların biyoteknolojik, çevre, gıda, ilaç ve toksiste çalışmaları açısından değerlendirilmesi.

Bu amaçla projede 5 iş paketi yer almaktadır. 1. Hava ve toprak (çevre), üzüm, midye ve peynir (gıda) örnekleri toplanarak spor oluşturmayan küf izolasyonu yapılacaktır. Klinikte ise hastanelerin laboratuvarlarından tanımlanamayan küf izolatları toplanacaktır. Toplanan örneklerinin fenotipik özellikleri ve besiyerinde enzim üretimleri, antimikrobiyal madde üretme yetenekleri, muhtemel mikotoksijenik olup olmadığı besiyerinde ve toplam sekonder metabolitleri İnce tabaka kromotografisi ile belirlenecektir. Sonrasında fenotipik özellikleri ve metabolit profilleri farklı 100 izolat seçilecektir. 2. Seçilen izolatların öncelikle ITS gen bölgesi ile moleküler tanımlamaları yapılacaktır. Burada amaç izolatların cins düzeyinde tanımlanmasıdır. Cins düzeyinde tanımlanan izolatlar için cinse göre 3 gen bölgesi daha seçilerek MLSA dizileri oluşturulacak ve kesin tür tayini yapılacaktır. 3. Kesin tür tayini yapılan izolatların MALDI-TOF MS ile tanımlanması için spektrumları oluşturulacak ve bu spektrumlar MLSA verileri ile eşleştirilecektir. 4. Kesin tür tayini yapılan izolatların FT-IR ile tanımlanması için spektrumları oluşturulacak ve bu spektrumlar MLSA verileri ile eşleştirilecektir. 5. Kesin tür düzeyinde tanımlanması yapılan ve hızlı tanımlama veritabanları oluşturulan izolatların metabolit profilleri belirlenecektir.

Tüm iş paketlerinde, literatürde verilen ve standart olan yöntemler kullanılacaktır. İş paketlerinde elde edilen veriler ile literatüre bu konuda ilk ve kapsamlı veriler sağlanmış olacaktır. Proje kapsamındaki iş paketlerinde yeni tür keşfi bulma olasılığı yüksektir. Bunula birlikte metabolit profillerinin belirlenmesi ile yeni biyoteknolojik, çevre, gıda, ilaç ve toksisite çalışmaları için kaynak oluşturmuş olacaktır. Proje kapsamında yapılacak lisansüstü tezler ile özellikle temel bilimlerde genç bilim insanlarının yetişmesine katkı sağlanacaktır. Spor oluşturmayan küfler ile ilgili olarak kapsamlı ve özgün bilgiler elde edilecektir. Düzenlenecek eğitim ile de bu konuda çalışan tıbbi mikrobiyolog, mikrobiyolog, gıda mikrobiyoloğu ve mikologlar ile bir araya gelerek bilgi paylaşımında bulunulacak ve projenin yaygın etkisi arttırılacaktır.